一、同源重组法质粒构建

同源重组法质粒构建在生物医学研究中具有广泛的应用，特别是在基因功能研究、蛋白表达和纯化等方面。该方法包括基因的敲除、敲低及过表达等技术，广泛用于探讨基因功能、表达调控机制以及其对细胞生理过程和表型的影响。此外，通过优化启动子、核糖体结合位点等表达元件，并选择合适的宿主细胞，利用同源重组法构建的表达载体可以使目标蛋白在宿主细胞中大量表达，从而有效实现目标蛋白的表达和纯化。

相较于传统的限制性内切酶切割方法，同源重组法依赖于DNA分子间的同源序列进行重组，因此其操作步骤显得尤为重要。

二、流程图

三、材料与仪器

构建所需的材料包括目的片段的cDNA、引物、载体、限制性内切酶、酶切buffer、LB培养基、含LB培养基的细菌培养皿、同源重组酶、高保真酶、感受态细胞DH5α、胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、EP管、离心管、移液枪及枪头等。

四、实验步骤

同源重组法构建质粒的具体步骤如下：

1. 根据目的片段的酶切位点，选择合适的内切酶，利用双酶切法将环状载体质粒线性化，并通过琼脂糖凝胶法回收酶切产物，按照试剂盒操作进行回收。
2. 使用PCR扩增目的片段的序列，并通过琼脂糖凝胶法回收扩增产物。
3. 将线性化载体与扩增片段按比例连接，在37℃反应30分钟或更长时间（1~2小时），将连接好的重组质粒（10μl）转入克隆感受态细胞DH5α，轻轻吹打均匀，后在冰上静置30分钟，然后进行42°C水浴热激90秒，立即置于冰上静置冷却2~3分钟。
4. 加入500μl不含抗生素的LB液体培养基，在37℃下摇菌1小时，转速250rpm。
5. 将上述菌液以5000rpm离心5分钟，弃去300μl上清，使用剩余培养基重悬菌体，按不同梯度涂板，以防止单克隆菌过密或过疏，用无菌涂布棒在含质粒抗性的平板上涂匀，放入37℃培养箱中培养10~12小时。
6. 经过过夜培养后，使用1μl枪头挑选单克隆菌，并置于含抗生素的5ml LB液体培养基中，继续培养10~12小时。
7. 利用质粒小提试剂盒提取菌液中的重组质粒后，用限制性内切酶消化，并进行琼脂糖电泳进行酶切鉴定。
8. 在第七步的同时，也可以取出部分菌液进行菌液PCR，PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，以进一步确认重组质粒的正确性。
9. 最终将鉴定成功的菌液送至测序公司进行双向测序，待序列结果比对正确后，标志着重组质粒构建成功，可进行后续实验。

五、实验相关产品推荐

以下是推荐的实验产品：

• 27106质粒小提试剂盒 - QIAprep Spin Miniprep Kit - 品牌：凯杰 (Qiagen)
• D200596孔酵母质粒小提试剂盒 - Zymoprep-96 Yeast Plasmid Miniprep - 品牌：Zymo Research
• TD407琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 - 品牌：简石生物

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